201912060851氣血流變:[]外泌體專題之二」:外泌體樣本來源與送樣建議

「外泌體專題之二」:外泌體樣本來源與送樣建議

 

 

 

 

上周小編給大家介紹火熱的外泌體研究的簡介,接下來趁熱打鐵,給大家介紹我們外泌體的第二個專題。俗話說,良好的開端是成功的一半,外泌體樣品的製備對於研究課題的順利開展有著舉足輕重的作用。

Exosomes are secreted by all mammalian cell type in culture[1]。對於想從事外泌體研究的小夥伴們是不是特別興奮!然而……對於不同的試驗、不同的樣品,取樣的注意事項有哪些?這些外泌體來源的樣本是否需要經過一定的預處理才能保存?怎麼確定提取的就是是外泌體?接下來小編將與大家一起探討!

外泌體取樣的注意事項及預處理方法

由於外泌體是來源於細胞質膜內陷的含有脂質雙分子層膜結構的多泡內體或MVB,存在於胞外基質。為了獲得高純度的外泌體,必須保證有效去除所有的細胞碎片及其他不需要的膜結構物。

血液類樣品

血液類樣品包含血清和血漿。對於血液樣本,溶血現象是一個不可忽視的大問題。發生溶血意味著紅細胞的破裂。血液發生溶血現象的樣本不建議繼續使用,因此,務必在採血後對血液樣本進行及時的處理,避免劇烈晃動。血清、血漿樣本的區別如下:

 

血清:離體的血液凝固之後,經血凝塊聚縮所釋出的液體。無纖維蛋白原和凝血因子,但在凝血過程中血小板會分泌大量的外泌體,所以,研究與血小板相關的疾病優先建議使用血清樣本。

血漿:離開血管的全血經抗凝處理後,通過離心沉澱,所獲得的不含細胞成分的液體。但血漿的樣本最大的缺點是有抗凝劑的干擾。

簡單地說,血清與血漿的區別在於前者缺乏纖維蛋白原和凝血因子而又增加了大量血小板釋放出來的外泌體污染。

 

 

圖1.血漿和血清的區別

對於血液樣本的預處理,其處理流程簡要介紹如下:

1. 血清樣品

1)用採血針和普通採血管(不含任何試劑)採血(10min內移至4℃環境靜置!)

2)4℃下靜置3~4小時,可見血塊析出

3)用移液器吸取上面的淡黃色血清至15ml離心管,4000 g,4℃離心10min,取出上清後可再1500 g,4℃離心10min,以最大程度保證血清質量

4)離心後的血清儘快凍存於-80℃冰箱

建議送樣量:3 mL以上

2. 血漿樣品(不能用肝素抗凝)

1) 用採血針和抗凝管(含 EDTA)抽取全血,輕柔混勻

2) 4℃條件下,4000 g,離心5min,取上清即為血漿,注意不要碰到底部和側面的沉澱物

3) 送樣前可凍存於-80℃

建議送樣量:4mL以上

推薦exosome抽提試劑盒:Ribo™ Exosome Isolation Reagent (for plasma or serum)

血液外的體液臨床樣品

這類樣品主要包括尿液、腦脊液、胸腔積液、肺泡灌洗液、胸腔灌洗液、唾液、羊水、乳汁等。血液外的體液樣品容易出現細菌污染或細胞RNA污染,需嚴格按照離心步驟離心取上清,最好過濾除菌。這裡我們主要以尿液為例,跟大家分享預處理注意事項:

1) 用15 mL或50mLl離心管收集尿液,最好是收集中段尿液

2) 如果使用15ml或者50ml離心管離心:1000-1500 g,4℃離心30min,去除細胞碎片等雜質,取上清,建議繼續用0.45μm 的濾頭過濾除菌

3) 送樣前凍存於-80℃

建議送樣量:40mL以上

推薦exosome抽提試劑盒:Ribo™ Exosome Isolation Reagent (for other body fluids)

除了以上大家常見的體液以外,我們還接過汗液外泌體研究的,不過小編嚴重不建議這類過於開放性環境來源的外泌體研究,這種樣品最大的風險在於可能存在各種微生物污染。

細胞上清

由於細胞培養過程易發生支原體污染,建議送樣前使用支原體去除試劑處理細胞並檢測常見支原體。

1) 細胞在正常含血清的培養基中培養一定時間,貼壁細胞密度到70% -80%,懸浮細胞密度到60%-70%時

2) 對於貼壁細胞,去除培養基,並用PBS清洗1-3遍;對於懸浮細胞,300 g,4℃,10 min收集細胞

3) 加入新的不含外泌體的培養基或使用無血清的培養基繼續培養 48h~72h ,根據細胞生長速率收集細胞上清

4) 收集細胞上清,700 g,4℃離心10min,去除殘留細胞,取上清,9000 g,4℃離心15min,徹底去除細胞碎片,取上清(注意避免吸入細胞或細胞碎片)

5) 送樣前可凍存於-80℃冰箱

建議送樣量:40 mL以上

推薦exosome抽提試劑盒:Ribo™ Exosome Isolation Reagent (for cell culture media)

注意事項:

1) 分離exosome 前的樣品不能加入任何RNA保護劑(如Trizol,RNA later);

2) 分離好的外泌體如需進行粒徑檢測或流式鑑定,需放4℃保存,並儘快進行實驗;

3) 不同樣品來源富集到的外泌體數量相差較大,因此,提取的RNA總量也相差很大。相對來說,血清、血漿外泌體樣品的外泌體含量較高。

外泌體的鑑定

外泌體的取樣如此小心,外泌體的富集如此難。歷經千辛萬苦。終於將手中的外泌體修成正果。可內心還是有一絲忐忑,手裡的外泌體究竟是不是外泌體?歷經萬難分離的外泌體純度又有多少?外泌體的鑑定是繼外泌體富集之後的又一難題。

目前主要的外泌體鑑定方法如下:

1、通過電鏡觀測樣本中是否存在外泌體樣結構物;(通常為茶托型)

2、外泌體的粒徑檢測;(銳博生物提供納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis NTA))

3、流式細胞儀檢測外泌體表面抗原標誌物。(銳博生物提供表面抗原標誌物CD63、CD81的檢測服務)

 

 

參考文獻:

  1. Vlassov A V, Magdaleno S, Setterquist R, et al. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 2012, 1820(7): 940-948.

  2. Steinbichler T B, Dudás J, Riechelmann H, et al. The Role of Exosomes in Cancer me tastasis[C]//Seminars in Cancer Biology. Academic Press, 2017.

來源:銳博生物


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